Kultivimi i baktereve: metoda, parime, hapa dhe kushte

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. E modifikuara e fundit: 2023-12-17 05:41

Mikroorganizmat në natyrën përreth nesh janë kudo: në tokë, trupa ujorë, në sipërfaqet e objekteve të ndryshme, njerëzit dhe kafshët janë të banuara prej tyre. E gjithë kjo mund të shërbejë si burim i ndotjes mikrobike të ushqimit, barnave dhe linjave të prodhimit. Kultivimi i baktereve është i nevojshëm për të studiuar vetitë, nevojat dhe karakteristikat e tyre. Ky, nga ana tjetër, është një hap i rëndësishëm në zhvillimin e barnave të ndryshme, diagnostikimin laboratorik të sëmundjeve, llogaritjen e reaktorëve të prodhimit dhe shumë më tepër.

Koncepte të përgjithshme

Kultivimi i baktereve në mikrobiologji i referohet kultivimit të mikroorganizmave që kryhet në laborator. Nga ana tjetër, mikrobet që janë rritur në një medium të zgjedhur ushqyes quhen kulturë. Kulturat mund të përzihen nëse formohen nga lloje të ndryshme mikroorganizmash dhe të pastra nëse përfaqësohen nga vetëm një lloj bakteri.

Nëse është ushqyeseNë mjedis vendoset vetëm një qelizë dhe si rezultat i riprodhimit të saj fitohet një grup individësh, atëherë ky grup mikroorganizmash quhet klon. Kur një klon zhvillohet deri në pikën ku bëhet i dukshëm me sy të lirë, ky koleksion bakteresh quhet koloni.

Zakonisht kultivimi i baktereve të izoluara nga burime të ndryshme kryhet veçmas nga njëra-tjetra. Secili grup i tillë i mikrobeve i rritur veçmas quhet një lloj. Pra, nëse një lloj stafilokoku izolohet nga tre burime (ose pjesë të ndryshme të të njëjtit produkt, njerëz të ndryshëm), ata flasin për tre lloje të këtij lloji stafilokoku.

Faktorët e rritjes së baktereve

Këta përfshijnë aminoacide të ndryshme, lipide, baza purine dhe komponime të tjera të nevojshme për zhvillimin e mikroorganizmave. Disa mikrobe mund të prodhojnë në mënyrë të pavarur substancat që u nevojiten, ndërsa të tjerët duhet t'i marrin ato në formë të përfunduar. Sipas nevojave të mikroorganizmave në faktorë të caktuar të rritjes, bëhet identifikimi dhe diferencimi i baktereve. Gjithashtu, ky parametër është i rëndësishëm për përgatitjen e duhur të një mediumi ushqyes për punë laboratorike dhe bioteknologjike:

Amino acide. Bakteret mund të kërkojnë një aminoacid të veçantë ose grup acidesh. Pra, klostridiet kanë nevojë për leucinë dhe tirozinë, streptokoket kanë nevojë për leucinë dhe argininë. Mikroorganizmat që kërkojnë aminoacide nga jashtë për t'u rritur quhen auxotrofe.
Bazat purine dhe pirimidine, si dhe derivatet e tyre (adenina, guanina dhe të tjera). Ata janë një faktor i rëndësishëm në rritjen e shumë njerëzveLlojet e streptokokut.
Vitamina. Ato janë pjesë e koenzimave të kërkuara nga bakteret. Pra, acidi nikotinik, si dhe amidi i tij, të cilat janë pjesë e NAD dhe NADP, nevojiten nga difteria dhe korynebakteret shigella. Tiamina, si pjesë përbërëse e pirofosfatit, kërkohet nga Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Acidi pantotenik, i cili është pjesë e koenzimës CoA, kërkohet nga bacilet e tetanozit dhe disa lloje të streptokokut. Citokromet, dhe rrjedhimisht acidi folik, hemet dhe biotina që i formojnë ato, janë të nevojshme për Mycobacterium tuberculosis dhe Haemophilus influenzae.

Kërkesat e Mjedisit

Kushtet për mjediset e kulturës për kultivimin e baktereve:

Ushqyerja. Ato duhet të përmbajnë substanca, për më tepër, në një formë lehtësisht të tretshme, të nevojshme që mikroorganizmat të ushqehen dhe të rimbushin energjinë. Këto përfshijnë organogjene dhe minerale. Disa mikroorganizma kërkojnë gjithashtu vitamina dhe aminoacide që nuk mund t'i sintetizojnë.
Niveli optimal i pH. Ndikon në përshkueshmërinë e membranës qelizore dhe, në përputhje me rrethanat, në aftësinë për të absorbuar lëndët ushqyese nga bakteri. Më shpesh, vlera e pH duhet të jetë në nivelin 7, 2-7, 4. Shumë mikroorganizma gjatë jetës së tyre prodhojnë produkte me reaksione acidike ose alkaline dhe në mënyrë që pH e lëndës ushqyese të mos ndryshojë, ajo duhet të jetë në bufer.
Izotonike. Presioni osmotik në mjedisin ushqyes për kultivimin e baktereve duhet të ketë të njëjtat vlera sibrenda qelizave mikrobike. Zakonisht korrespondon me një zgjidhje 0,5% NaCl.
Sterilitet. Kjo për faktin se shfaqja e baktereve të huaja do të shtrembërojë rezultatet e studimit të sojit të analizuar.
Niveli i lagështisë. Ky tregues, së bashku me konsistencën e mediumit, duhet të ketë karakteristika optimale për një lloj të caktuar bakteri.
Potenciali redoks (RH2). Ai tregon raportin e substancave që dhurojnë dhe pranojnë elektrone, si dhe nivelin e ngopjes me oksigjen të mediumit ushqyes. Për aerobet dhe anaerobet, kushtet për kultivimin e baktereve ndryshojnë disi në këtë tregues. Mikroorganizmat anaerobe riprodhohen më së miri në vlerat e RH2 nën 5 dhe mikroorganizmat aerobikë të paktën 10.
Uniformitet. Është e rëndësishme që mjedisi i kulturës të përmbajë sasi konstante të përbërësve të tij individualë. Përveç kësaj, preferohen zgjidhje të qarta, të cilat e bëjnë më të lehtë monitorimin e rritjes së të korrave ose vërejtjen e kontaminimit.

Llojet e mediave kulturore

Zgjedhja e një mjedisi të veçantë për rritjen e mikroorganizmave ndikohet nga shumë faktorë, ndër të cilët janë karakteristikat e të ushqyerit të tyre dhe qëllimi i studimit. Karakteristikat kryesore të klasifikimit të lëndëve ushqyese janë:

1. Komponentët. Sipas substancave fillestare të përdorura për krijimin e substratit, ato dallojnë:

natyrale, të cilat përgatiten nga produkte me origjinë shtazore ose bimore (p.sh. mish, qumësht, fruta) dhe janë të përshtatshme për rritje të përzierakulturat;
gjysmë sintetike, në të cilën produktet e shtrenjta ushqimore natyrale zëvendësohen nga produkte jo ushqimore (për shembull, mielli i kockave, mpiksja e gjakut) dhe që janë optimale për kultivimin e disa llojeve të baktereve ose izolimin e produkteve të tyre metabolike nga mjedisi;
sintetike, të cilat përgatiten nga sasi të sakta të përbërjeve kimike, kanë një përbërje të njohur konstante dhe janë lehtësisht të riprodhueshme.

2. Konsistenca (dendësia). Dalloni mjediset:

lëng;
të dendur;
gjysmë i lëngshëm.

Dy të fundit përgatiten nga solucione speciale ose substanca të lëngshme me shtimin e agar-agarit ose xhelatinës për të krijuar densitetin e kërkuar. Përveç kësaj, një mjedis i dendur për rritjen e baktereve është serumi i gjakut të mpiksur, patatet, media xhel silicë, karragjenani.

3. Kompleksi. Mbi këtë bazë, mjediset janë:

e thjeshtë, lista e të cilave është e shkurtër është Meat Pepton Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Pepton Agar (MPA), xhelatinë ushqyese dhe ujë pepton.
kompleks, i përgatitur nga ato të thjeshta me shtimin e gjakut, hirrës, karbohidrateve dhe substancave të tjera.

4. Emërimi. Dallohen lëndët ushqyese të mëposhtme:

kryesore përdoren për të rritur shumë mikrobe patogjene (zakonisht përbërje të thjeshtë);
të veçanta përdoren për të izoluar dhe kultivuar baktere që nuk rriten në nënshtresa të thjeshta;
selektive (ato janë gjithashtu selektive) janë të përshtatshme për izolimin e një lloji specifik të baktereve dhe pengojnë rritjen e mikrobeve shoqëruese (selektivitetikrijuar duke shtuar substanca të caktuara në media, të tilla si antibiotikë ose kripëra, ose duke rregulluar pH);
diagnostika diferenciale bën të mundur dallimin e një lloji bakteri nga një tjetër duke vlerësuar aktivitetin enzimatik, për shembull, të mediumit;
duhen konservues për inokulimin fillestar me transportin e mëvonshëm të mostrave, pasi parandalojnë vdekjen e mikroorganizmave, si dhe pengojnë rritjen e baktereve të tjera.

Përgatitja për media

Hapi më i rëndësishëm në kultivimin e baktereve anaerobe është përgatitja e një mjedisi të përshtatshëm ushqyes. Pasi të përzgjidhen parametrat optimalë, vazhdoni në fazat e mëposhtme:

peshimi, duke zgjedhur një mostër të komponentëve në një bilanc analitik;
shpërbërja kryhet në ujë të distiluar të ngrohur në 70 ° C dhe fosfatet, mikro- dhe makrokripërat treten veçmas;
zihet në një banjë uji për dy minuta;
përcaktimi i pH me letër treguese ose potenciometër;
filtrim përmes pëlhurës së lagur ose filtrave letre për media të dendura të lëngshme si dhe të shkrira, dhe përmes një filtri me garzë pambuku për media agar;
mbushja e kryer me kapacitet 3/4;
sterilizimi i varur mesatar;
kontrolli për sterilitetin kryhet duke vendosur për dy ditë në një termostat, pasuar nga shikimi;
kontroll kimik për të vendosur pH dhe përmbajtjen e nevojshmeartikuj;
kontrolli biologjik me inokulim provë.

Sterilizimi i enëve të qelqit dhe mediave

Një nga parimet bazë të kultivimit bakterial është steriliteti. Rritja dhe zhvillimi i mikroorganizmave të huaj mund të ndikojë në karakteristikat e mediumit ushqyes duke ndryshuar përbërjen e tij kimike dhe pH. Sterilizimi është kushti kryesor për rritjen e kulturave të pastra. Në praktikë, ky term nënkupton metodat e shkatërrimit të absolutisht të gjitha formave të jetës në sipërfaqe dhe në vëllimin e objekteve të sterilizuara. Enët, instrumentet e përdorura, media dhe sende të tjera të përdorura gjatë studimit janë sterilizuar.

Disa lloje sterilizimi:

Ndezja. Sterilizimi i sytheve dhe gjilpërave për mbjellje, rrëshqitësit e qelqit, disa instrumenteve mund të kryhet duke përdorur një djegës ose llambë shpirtërore.
Vlim. I përshtatshëm për trajtimin e shiringave, gjilpërave, ushqimit, por nuk vret sporet bakteriale.
Sterilizimi me nxehtësi të thatë. Ai kryhet në një kabinet të posaçëm tharjeje dhe është i përshtatshëm për përpunimin e balonave, provëzave dhe enëve të tjera qelqi laboratorike.
Sterilizimi me avull. E kryer në një autoklavë, kjo metodë është shumë efektive. Por nuk është i përshtatshëm për lëndë ushqyese që përmbajnë proteina ose ndonjë përbërje tjetër që shpërbëhet në temperatura të larta. Më e kursyer mund të quhet tyndalizim. Ajo kryhet në Kaldanë Koch dhe ndërthur mbirjen e sporeve me shkatërrimin e tyre.
Pasterizim. Përdoret për media që ndryshojnë vetitë e tyre kur zihen (për shembull, qumështi, vera, birra), të aftë për tëshpëtoj nga mikroorganizmat që nuk përmbajnë spore. Temperatura e përpunimit është vetëm 50-60 ° C për pesëmbëdhjetë deri në tridhjetë minuta. Në disa raste, përdoret sterilizimi i ftohtë, i cili kryhet duke përdorur filtra ose rreze UV.

Kushtet e kultivimit të baktereve

Rritja dhe zhvillimi i baktereve është i mundur vetëm nën disa faktorë dhe vlerat e secilit prej tyre:

1. Temperatura. Ekzistojnë tre grupe bakteresh që ndryshojnë në preferencat e temperaturës:

termofilët, ose mikrobet që e duan nxehtësinë, rriten në 45-90°C, që do të thotë se ata nuk shumohen në organizmat e njeriut dhe të kafshëve;
psikrofilët, ose mikroorganizmat që e duan të ftohtin, preferojnë temperaturat në intervalin 5-15 °C dhe rriten në depo të ftohta;
mesofile, zhvillohen në një temperaturë prej 25-37 ° C, ato përfshijnë pjesën më të madhe të baktereve.

2. Drita. Është veçori e kultivimit të baktereve fototrofike, pasi ato kryejnë procesin fotosintetik. Por për shumicën e mikrobeve, ndriçimi nuk është një parakusht. Dhe madje anasjelltas, ultravjollca diellore mund të shtypë zhvillimin e tyre.

3. Uji. Të gjithë mikroorganizmat kanë nevojë për ujë në një formë të aksesueshme (të lëngshme). Kjo është arsyeja pse ushqimi i ngrirë ka pak ose aspak rritje të baktereve.

4. Aciditeti i mjedisit. Ky parim i kultivimit të baktereve tashmë është diskutuar në detaje më sipër.

5. Ajrimi. Oksigjeni, si element kimik, është pjesë përbërëse e ujit dhe një numër i konsiderueshëm përbërësish që përdoren përkultivimi i mikroorganizmave. Oksigjeni i gaztë gjithashtu mund të përmbahet në ujë dhe lëngje të tjera në formë të tretur. Një pjesë e konsiderueshme e baktereve kanë nevojë për një furnizim të vazhdueshëm të molekulave të oksigjenit. Por për një numër mikroorganizmash, është e panevojshme, ose, më keq, oksigjeni i gaztë është toksik për ta, pasi ato nuk kanë katalazë dhe peroksidazë, të cilat shkatërrojnë produktet toksike të frymëmarrjes. Prandaj, hapi më i rëndësishëm në kultivimin e baktereve anaerobe është heqja e molekulave O₂ nga mediumi ushqyes.

6. Kultivimi i mikroorganizmave. Kultivimi i baktereve aerobe dhe anaerobe kryhet në shtresa të ndryshme të mjedisit dhe në mënyra të ndryshme.

Kultivimi i mikroorganizmave aerobe

Kultivimi i baktereve aerobe kërkon oksigjen molekular. Për të marrë kultura të pastra të aerobeve që mund të përdoren me sukses në mjekësi dhe industri ushqimore, përdoren metodat e mëposhtme:

sipërfaqe që rritet në media të dendura ose në media të lëngshme (shtresa e tyre e hollë) kur oksigjeni vjen direkt nga ajri;
kultivim i thellë në mjedise të lëngshme, kur një rritje e sasisë së oksigjenit të tretur në to arrihet me ajrim konstant.

Kultivimi i mikroorganizmave anaerobe

Parimi bazë i kultivimit të baktereve të këtij lloji është kontakti i tyre minimal me oksigjenin atmosferik. Sigurimi i kushteve për rritjen e tyre është shumë më i vështirë sesa për aerobet. Metodat e mëposhtme përdoren për të izoluar anaerobet nga O₂:

Fizike. Kjo metodë e kultivimit të baktereve anaerobe reduktohet në kultivimin e tyre në një aparat të veçantë vakum - një mikroanaerostat. Ajri në të zëvendësohet nga një përzierje gazi speciale azoti me shtimin e 10% hidrogjen dhe 5% dioksid karboni.
Kimike. Këto përfshijnë: përdorimin e agjentëve absorbues (p.sh. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) ose agjentë reduktues (si acidi askorbik).
Biologjik. Bëhet fjalë për bashkë-kultivimin e aerobeve dhe anaerobeve në një sistem të mbyllur. Kjo metodë e kultivimit të baktereve përfshin mbjelljen e gjysmës së një pjate Petri me disa nga speciet aerobike të baktereve dhe gjysmën tjetër me anaerobin e studiuar. Zhvillimi i tij do të fillojë në momentin kur të jetë konsumuar i gjithë oksigjeni.

Metodat e mëposhtme të mbjelljes janë të përshtatshme për kultivimin e baktereve anaerobe:

në shtresën sipërfaqësore;
në shtresën sipërfaqësore të mbushur me parafinë sterile;
në masën e një mediumi të dendur ushqyes;
në shtresa të thella të mediave viskoze.

Marrja e kulturës së pastër

Mikrobiologët zakonisht punojnë me mostra të banuara nga shumë lloje të ndryshme mikrobesh. Megjithatë, për të përcaktuar pozicionin sistematik të mikroorganizmave (familje, gjini, specie), si dhe për të studiuar karakteristikat e tyre, është e nevojshme të izolohen ato dhe të rritet një kulturë e pastër. Ato kanë një rëndësi të madhe në shumë industri ushqimore, për shembull, djathë, bukë, kvas, verë, etj. Kultivimi i baktereve të acidit laktik bën të mundur marrjen enjë komponent thelbësor për prodhimin e produkteve të qumështit të fermentuar, brumit, kakaos, silazhit dhe madje edhe plastikës.

Metoda e izolimit të një kulture të pastër në një mjedis të dendur bazohet në ndarjen mekanike të qelizave të mikroorganizmave me kultivimin e tyre pasues të izoluar. Mostra transferohet në një vëllim steril uji ose fiziologjik (vëllimi 10-100 ml) dhe më pas tundet për dy minuta. Për nxjerrjen e mikroorganizmave të vendosur në trashësinë e materialit në studim (për shembull, salsiçe ose djathë), fillimisht kryhet fërkimi i pjesëve të mostrës me instrumente sterile me rërë. Materiali që i është nënshtruar përgatitjes paraprake, me peshë 1 g ose vëllim 1 ml, hollohet me ujë steril 10, 100, 1000, etj. Është zgjedhur shkalla e hollimit që jep një përqendrim të qelizave që korrespondon me aftësitë e metodës.

Kultivimi i mëpasshëm i mikroorganizmave është përgatitja e një mjedisi ushqyes. Zakonisht zgjidhet një medium i dendur (MPA). Fillimisht shkrihet dhe ftohet në 45-50 °C dhe vetëm më pas hidhet në disa enë Petri (tre deri në pesë copë), në fund të të cilave vendosen shtupa nga lënda e provës me përqendrime të ndryshme. Më pas, kryhet përzierja e lëndës ushqyese ende të pa ngrirë dhe e materialit të futur në të. Kështu fiksohen qelizat në pika të ndryshme të vëllimit të substratit.

Më pas, enët Petri vendosen në një termostat për 2 ditë në 22 °C. Gjatë kësaj kohe, qelizat shumohen në atë masë sa kolonia e formuar nga secila prej qelizave bëhet e dukshme me sy të lirë. Secila prej tyre është një kulturë e pastër e llojit të baktereve nga qelizat e të cilave ështëtrëndafil.

Më pas, nga enët Petri, mikroorganizmat nënkulturohen në epruveta të veçanta të mbushura me një mjedis ushqyes. Në këtë mënyrë, kulturat e pastra izolohen nga një mostër e përzier. Kjo metodë mban emrin e zhvilluesit të saj - R. Koch. Zakonisht quhet edhe metoda e filxhanit, ose mbjellja e varfëruar. Pas marrjes së kulturave të pastra të llojeve të ndryshme të baktereve, përcaktohen forma, sporet dhe familjet e tyre.

E gjithë puna duhet të kryhet sipas parimeve të asepsis. Për të shmangur zhvillimin e parakohshëm të mikroorganizmave, studimi duhet të kryhet menjëherë pas marrjes së mostrës. Uji i rubinetit analizohet pas kullimit të pjesëve të para, pasi ato mund të përmbajnë mikrobe të grumbulluara në tuba dhe çezma. Mikroflora e frutave, manave dhe perimeve është e vendosur kryesisht në sipërfaqe (lëvozhgë), prandaj, larjet kryhen prej saj. Për ta bërë këtë, vendoseni fetusin në një enë sterile dhe mbusheni me sasinë e nevojshme të ujit. Më pas ato tunden mjaft fuqishëm dhe uji hidhet në një enë tjetër. Të lashtat nga produktet e pëlhurës merren gjithashtu në shtupë, por paraprakisht, copa të një madhësie të caktuar priten prej tyre.