Thithja dhe riemetimi i mëtejshëm i dritës nga media inorganike dhe organike është rezultat i fosforeshencës ose fluoreshencës. Dallimi midis fenomeneve është gjatësia e intervalit midis thithjes së dritës dhe emetimit të rrymës. Me fluoreshencë, këto procese ndodhin pothuajse njëkohësisht, dhe me fosforeshencë, me njëfarë vonese.
Sfondi historik
Në vitin 1852, shkencëtari britanik Stokes përshkroi për herë të parë fluoreshencën. Ai e shpiku termin e ri si rezultat i eksperimenteve të tij me fluorparin, i cili lëshonte dritë të kuqe kur ekspozohej ndaj dritës ultravjollcë. Stokes vuri në dukje një fenomen interesant. Ai zbuloi se gjatësia e valës së dritës fluoreshente është gjithmonë më e gjatë se ajo e dritës së ngacmimit.
Shumë eksperimente u kryen në shekullin e 19-të për të konfirmuar hipotezën. Ata treguan se një shumëllojshmëri mostrash fluoreshojnë kur ekspozohen ndaj dritës ultravjollcë. Materialet përfshijnë, ndër të tjera, kristalet, rrëshirat, mineralet, klorofilin,lëndët e para medicinale, përbërjet inorganike, vitaminat, vajrat. Përdorimi i drejtpërdrejtë i ngjyrave për analiza biologjike filloi vetëm në vitin 1930
Përshkrim i mikroskopit fluoreshent
Disa nga materialet e përdorura në kërkime në gjysmën e parë të shekullit të 20-të ishin shumë specifike. Falë treguesve që nuk mund të arriheshin me metoda kontrasti, metoda e mikroskopit fluoreshent është bërë një mjet i rëndësishëm si në kërkimin biomjekësor ashtu edhe në atë biologjik. Rezultatet e marra ishin të një rëndësie të vogël për shkencën e materialeve.
Cilat janë përfitimet e mikroskopit fluoreshent? Me ndihmën e materialeve të reja, u bë i mundur izolimi i qelizave dhe përbërësve submikroskopik shumë specifikë. Një mikroskop fluoreshent ju lejon të zbuloni molekula individuale. Një shumëllojshmëri ngjyrash ju lejojnë të identifikoni disa elementë në të njëjtën kohë. Megjithëse rezolucioni hapësinor i pajisjes është i kufizuar nga kufiri i difraksionit, i cili, nga ana tjetër, varet nga vetitë specifike të kampionit, zbulimi i molekulave nën këtë nivel është gjithashtu mjaft i mundshëm. Mostrat e ndryshme shfaqin autofluoreshencë pas rrezatimit. Ky fenomen përdoret gjerësisht në petrologji, botanikë, industri gjysmëpërçuese.
Karakteristikat
Studimi i indeve shtazore ose mikroorganizmave patogjenë shpesh ndërlikohet nga autofluoreshenca jo specifike ose shumë e dobët ose shumë e fortë. Megjithatë, vlera nëkërkimi fiton futjen në material të përbërësve të ngacmuar në një gjatësi vale specifike dhe që lëshojnë një fluks drite të intensitetit të kërkuar. Fluorokromet veprojnë si ngjyra të afta për t'u vetë-lidhur me strukturat (të padukshme ose të dukshme). Në të njëjtën kohë, ato dallohen nga selektiviteti i lartë në lidhje me objektivat dhe rendimentin kuantik.
Mikroskopi fluoreshent është bërë gjerësisht i përdorur me ardhjen e ngjyrave natyrale dhe sintetike. Ato kishin profile specifike të emetimit dhe intensitetit të ngacmimit dhe synonin objektiva specifike biologjike.
Identifikimi i molekulave individuale
Shpesh, në kushte ideale, mund të regjistroni shkëlqimin e një elementi të vetëm. Për ta bërë këtë, ndër të tjera, është e nevojshme të sigurohet zhurma mjaft e ulët e detektorit dhe sfondi optik. Një molekulë fluoresceine mund të lëshojë deri në 300,000 fotone përpara shkatërrimit për shkak të zbardhjes së fotove. Me një normë grumbullimi 20% dhe efikasitet procesi, ato mund të regjistrohen në shumën prej rreth 60 mijë
Mikroskopi fluoreshent, i bazuar në fotodiodat e ortekëve ose shumëzimin e elektroneve, i lejoi studiuesit të vëzhgonin sjelljen e molekulave individuale për sekonda, dhe në disa raste minuta.
Vështirësi
Problemi kryesor është shtypja e zhurmës nga sfondi optik. Për shkak të faktit se shumë nga materialet e përdorura në ndërtimin e filtrave dhe lenteve shfaqin njëfarë autofluoreshence, përpjekjet e shkencëtarëve në fazat fillestare u përqendruan në nxjerrjenkomponentë me fluoreshencë të ulët. Megjithatë, eksperimentet e mëvonshme çuan në përfundime të reja. Në veçanti, mikroskopi fluoreshent i bazuar në reflektimin total të brendshëm është gjetur se arrin një sfond të ulët dhe dalje të dritës me ngacmim të lartë.
Mekanizmi
Parimet e mikroskopisë së fluoreshencës bazuar në reflektimin total të brendshëm janë përdorimi i një valë që kalbet shpejt ose që nuk përhapet. Ajo lind në ndërfaqen midis mediave me indekse të ndryshme refraktive. Në këtë rast, rrezja e dritës kalon nëpër një prizëm. Ka një indeks të lartë thyerjeje.
Prizmi është ngjitur me një tretësirë ujore ose xhami me parametra të ulët. Nëse rrezja e dritës drejtohet në të në një kënd që është më i madh se ai kritik, rrezja reflektohet plotësisht nga ndërfaqja. Ky fenomen, nga ana tjetër, krijon një valë jo-përhapëse. Me fjalë të tjera, gjenerohet një fushë elektromagnetike që depërton në një mjedis me një indeks thyes më të ulët në një distancë prej më pak se 200 nanometra.
Në një valë që nuk përhapet, intensiteti i dritës do të jetë mjaft i mjaftueshëm për të ngacmuar fluoroforet. Megjithatë, për shkak të thellësisë së tij jashtëzakonisht të cekët, vëllimi i tij do të jetë shumë i vogël. Rezultati është një sfond i nivelit të ulët.
Modifikimi
Mikroskopi fluoreshent i bazuar në reflektimin total të brendshëm mund të realizohet me epi-ndriçim. Kjo kërkon lente me hapje numerike të rritur (të paktën 1.4, por është e dëshirueshme që të arrijë 1.45-1.6), si dhe një fushë të ndriçuar pjesërisht të aparatit. Kjo e fundit arrihet me një njollë të vogël. Për uniformitet më të madh, përdoret një unazë e hollë, përmes së cilës bllokohet një pjesë e rrjedhës. Për të marrë një kënd kritik pas të cilit ndodh reflektimi total, nevojitet një nivel i lartë i thyerjes së mediumit të zhytjes në thjerrëza dhe xhamin e mbulesës së mikroskopit.
