Ngjyra gram përdoret gjerësisht në mikrobiologji pasi është një nga mënyrat më të lehta për të diferencuar bakteret bazuar në përbërjen e murit të tyre qelizor. Sipas Gramit, të gjitha bakteret mund të ndahen në gram-pozitive (Gram (+)) dhe gram-negative (Gram (-)). Metoda e ngjyrosjes Gram u zhvillua në 1884 dhe nuk e ka humbur popullaritetin që atëherë, megjithëse është modifikuar disa herë.
Struktura e murit qelizor
Ngjyrosja me gram zbulon nëse një bakter është Gram-pozitiv apo Gram-negativ. Ndarja e baktereve në Gram (+) dhe Gram (-) kryhet në përputhje me strukturën e murit të tyre qelizor.
Muri qelizor përmban sasinë më të madhe të peptidoglikanit (mureinë) - një substancë komplekse, e cila përfshin peptapeptid dhe glikan. Glikani përbëhet nga mbetje të alternuara të N-acetilglukozaminës dhe acidit N-acetilmuramic të lidhura me njëri-tjetrin nga β-1,Lidhjet 4-glikozidike. Peptidoglikani siguron mirëmbajtjen e formës së qelizave, mbrojtje osmotike dhe funksione antigjenike.
Dallimet kryesore midis baktereve Gram-pozitive dhe Gram-negative
Baktere të ndryshme kanë trashësi të ndryshme të shtresës peptidoglikane. Në bakteret që klasifikohen si gram-pozitive ajo varion nga 15 deri në 80 nm, ndërsa në gram-negative është nga 2 deri në 8 nm. Në të njëjtën kohë, bakteret Gram-negative kanë një strukturë të veçantë nën shtresën e peptidoglikanit, të cilën bakteret gram-pozitive nuk e kanë - hapësirën periplazmike. Kjo hapësirë është e mbushur me enzima hidrolitike - β-laktamaza, ribonukleaza 1, fosfataza. Janë këto enzima që janë përgjegjëse për rezistencën e baktereve gram-negative ndaj shumë antibiotikëve.
Shresa Gram(-) peptidoglikane e baktereve është e lidhur me lipopolisakaridin, një strukturë antigjenike që përmban endotoksina. Në bakteret Gram(+), acidet teikoike kryejnë funksione të ngjashme.
Bakteret gram-negative kanë një strukturë shtesë - membranën e jashtme.
Esenca e metodës së ngjyrosjes
Para se të filloni ngjyrosjen, përgatiten njollat e baktereve të studiuara. Për ta bërë këtë, uji hidhet në një rrëshqitje xhami dhe një kulturë mikroorganizmash shtohet atje me një lak bakterial. Më pas, pasi uji të jetë tharë plotësisht, njollosja fiksohet - rrëshqitja e xhamit bartet disa herë mbi flakën e djegësit. Ngjyrosja me gramë është më efektive se ngjyrosja e baktereve të gjalla - molekulat e bojës lidhen më mirë me qelizat e vdekura.
Ngjyrosja bëhet në disa faza:
- Copa të vogla letre filtri vendosen në një njollë fikse dhe derdhet boja kryesore - vjollcë gentian ose blu metilen.
- Pas 3-5 minutash, hiqni letrën filtri me ngjyrë dhe mbushni njollën me tretësirën Lugol për 1 minutë. Në këtë rast, preparati errësohet.
- Tretësira Lugol kullohet dhe njolla trajtohet me alkool të pastër etilik: disa pika hidhen mbi preparat, kullohen pas 20 sekondash. Procedura përsëritet 2-3 herë.
- Shpëlajeni rrëshqitjen e provës me ujë të distiluar.
- Prodhoni ngjyrosje shtesë - përfundoni përgatitjen me fuchsin. Pas 1-2 minutash, boja lahet.
- Pasi uji të thahet, ekzaminoni njollën nën mikroskop. Bakteret gram-pozitive do të jenë blu-vjollcë, bakteret gram-negative do të jenë rozë ose të kuqe.
Shkaktarët e modeleve të ndryshme të ngjyrosjes
Siç u përshkrua më sipër, ngjyrosja me Gram e baktereve i njollos bakteret gram-pozitive blu-vjollce, ndërsa bakteret gram-negative njollosen me ngjyrë të kuqe ose rozë. Arsyeja e ngjyrosjes diferenciale të baktereve me këtë metodë është se pasi forma e tretshme e violetës gentiane hyn në qelizë, boja kalon në formën e jodit të patretshëm. Gjatë trajtimit të baktereve me alkool etilik, lipidet nxirren nga membrana nën veprimin e këtij tretësi jopolar. Membrana më pas bëhet poroze dhe nuk është më një pengesë e rëndësishme për kullimin e bojës. Megjithatëpeptidoglikani është më rezistent ndaj tretësve jopolarë, përfshirë alkoolin. Është ai që parandalon larjen e bojës, kështu që bakteret me një shtresë të trashë mureine kthehen në blu-vjollcë (gram-pozitive), dhe pas trajtimit me alkool nuk ndryshojnë ngjyrën e tyre.
Shtesa e hollë mureine e baktereve gram-negative nuk mund të mbajë molekulat e bojës në qelizë, kështu që pas veprimit të alkoolit ato bëhen të pangjyrë - njolla gram-negative.
Pas ekspozimit të një njollosjeje ndaj fuchsin, bakteret e ngjyrosura me Gram mbeten blu-vjollcë, ndërsa bakteret gram-negative bëhen rozë-të kuqe.
Shembuj të baktereve Gram(+) dhe Gram(-)
Bakteret gram-negative përfshijnë cianobakteret, bakteret e squfurit, bakteret e hekurit, klamidia, rikecia, bakteret acetike, shumë metilobaktere, bakteret tionike, arsenitobakteret, karboksibakteret.
Bifidobakteret, shumë baktere ujore, streptokokë dhe stafilokokë janë gram-pozitiv.
