Metodat e kërkimit biologjik molekular luajnë një rol të madh në mjekësinë moderne, mjekësinë ligjore dhe biologjinë. Falë përparimeve në studimin e ADN-së dhe ARN-së, një person është në gjendje të studiojë gjenomën e një organizmi, të përcaktojë agjentin shkaktar të një sëmundjeje, të njohë acidin nukleik të dëshiruar në një përzierje acidesh etj.
Metodat e kërkimit biologjik molekular. çfarë është?
Në vitet '70 dhe '80, shkencëtarët për herë të parë arritën të deshifrojnë gjenomin njerëzor. Kjo ngjarje i dha shtysë zhvillimit të inxhinierisë gjenetike dhe biologjisë molekulare. Studimi i vetive të ADN-së dhe ARN-së ka çuar në faktin se tani është e mundur të përdoren këto acide nukleike për të diagnostikuar një sëmundje, duke studiuar gjenet.
Marrja e ADN-së dhe ARN-së
Metodat e diagnostikimit biologjik molekular kërkojnë praninë e materialit fillestar: më shpesh janë acidet nukleike. Ka disa mënyra për të izoluar këto substanca nga qelizat e organizmave të gjallë. Secila prej tyre ka avantazhet dhe disavantazhet e veta, dhe është e nevojshmemerrni parasysh kur zgjidhni një metodë për izolimin e acideve nukleike të pastra.
1. Marrja e ADN-së sipas Marmur. Metoda konsiston në trajtimin e një përzierje substancash me alkool, si rezultat i së cilës precipiton ADN-ja e pastër. Disavantazhi i kësaj metode është përdorimi i substancave agresive: fenoli dhe kloroformi.
2. Izolimi i ADN-së sipas Boom. Substanca kryesore e përdorur këtu është tiocianati i guanidinës (GuSCN). Kontribuon në precipitimin e acidit deoksiribonukleik në substrate të specializuara, nga të cilat mund të mblidhet më pas duke përdorur një tampon të veçantë. Megjithatë, GuSCN është një frenues i PTC, dhe madje një pjesë e vogël e tij që futet në ADN-në e precipituar mund të ndikojë në rrjedhën e reaksionit zinxhir të polimerazës, i cili luan një rol të rëndësishëm në punën me acidet nukleike.
3. Sedimentimi i papastërtive. Metoda ndryshon nga ato të mëparshme në atë që nuk precipitohen molekulat e acidit deoksiribonukleik, por papastërtitë. Për ta bërë këtë, përdoren shkëmbyesit e joneve. Disavantazhi është se jo të gjitha substancat mund të precipitojnë.
4. Ekzaminimi masiv. Kjo metodë përdoret në rastet kur nuk nevojitet informacion i saktë për përbërjen e molekulës së ADN-së, por është e nevojshme të merren disa të dhëna statistikore. Kjo shpjegohet me faktin se struktura e acidit nukleik mund të dëmtohet kur trajtohet me detergjentë, veçanërisht me alkale.
Klasifikimi i metodave të kërkimit
Të gjitha metodat e kërkimit biologjik molekular ndahen në tre grupe të mëdha:
1. Amplifikimi (duke përdorur shumë enzima). Këtui referohet PCR - reaksionit zinxhir të polimerazës, i cili luan një rol të madh në shumë nga metodat diagnostikuese.
2. Jo përforcues. Ky grup metodash lidhet drejtpërdrejt me funksionimin e përzierjeve të acideve nukleike. Shembuj janë 3 blote, hibridizimi në vend, etj.
3. Metodat e bazuara në njohjen e një sinjali nga një molekulë sondë që lidhet me një ADN ose ARN specifike të sondës. Një shembull është sistemi i kapjes hibride (hc2).
Enzimat që mund të përdoren në metodat e kërkimit të biologjisë molekulare
Shumë metoda të diagnostikimit molekular përfshijnë përdorimin e një game të gjerë enzimash. Më poshtë janë më të përdorurat:
1. Enzima kufizuese - "pret" molekulën e ADN-së në pjesët e nevojshme.
2. ADN polimeraza - sintetizon një molekulë me dy fije të acidit deoksiribonukleik.
3. Transkriptaza e kundërt (revertaza) - përdoret për të sintetizuar ADN-në në një shabllon ARN.
4. ADN-ligaza - përgjegjëse për formimin e lidhjeve fosfodiesterike ndërmjet nukleotideve.
5. Eksonukleaza - heq nukleotidet nga seksionet terminale të molekulës së acidit deoksiribonukleik.
PCR është metoda kryesore e amplifikimit të ADN-së
Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) përdoret në mënyrë aktive në biologjinë molekulare moderne. Kjo është një metodë në të cilën një numër i madh i kopjeve mund të merret nga një molekulë e vetme e ADN-së (molekulat amplifikohen).
Funksionet kryesore të PCR:
- diagnostikimsëmundje;
- klonimi i segmenteve të ADN-së, gjeneve.
Elementët e mëposhtëm janë të nevojshëm për të kryer një reaksion zinxhir polimerazë: molekula fillestare e ADN-së, një polimerazë e ADN-së e qëndrueshme (Taq ose Pfu), fosfate deoksiribonukleotide (burimet e bazave azotike), abetare (2 abetare për 1 molekulë ADN-je).) dhe vetë sistemi bufer, në të cilin të gjitha reagimet janë të mundshme.
PCR përbëhet nga tre hapa: denatyrimi, pjekja e primerit dhe zgjatja.
1. Denatyrim. Në një temperaturë prej 94-95 gradë Celsius prishen lidhjet hidrogjenore ndërmjet dy vargjeve të ADN-së dhe si rezultat fitojmë dy molekula njëvargëshe.
2. Pjekja me abetare. Në një temperaturë prej 50-60 gradë Celsius, abetaret ngjiten në skajet e molekulave të acidit nukleik me një fije floku sipas llojit të komplementaritetit.
3. Zgjatimi. Në një temperaturë prej 72 gradë, ndodh sinteza e molekulave të bijës me dy fije të acidit deoksiribonukleik.
sekuenca e ADN-së
Metodat e kërkimit biologjik molekular shpesh kërkojnë njohuri për sekuencën nukleotide në një molekulë të acidit deoksiribonukleik. Sekuenca kryhet për të përcaktuar kodin gjenetik. Diagnostifikimi molekular i së ardhmes do të bazohet në njohuritë e marra nga sekuenca njerëzore.
Dalohen llojet e mëposhtme të renditjes:
- Radhitja Maxam-Gilbert;
- Radhitja e Sanger;
- pyrosequencing;
- nanoporerenditja.
