Kur studiohen substanca në kiminë organike, përdoren më shumë se një duzinë reaksione të ndryshme cilësore për të përcaktuar përmbajtjen e përbërjeve të caktuara. Një analizë e tillë vizuale ju lejon të kuptoni menjëherë nëse substancat e nevojshme janë të pranishme dhe nëse ato nuk janë të pranishme, mund të reduktoni ndjeshëm eksperimentet e mëtejshme për t'i identifikuar ato. Këto reaksione përfshijnë ninhidrinën, e cila është kryesore në përcaktimin vizual të përbërjeve amino.
Çfarë është kjo?
Ninhidrin është një përbërje dikarbonil që përmban një unazë aromatike me një heterocikël të lidhur me të, atomi i dytë i të cilit ka 2 grupe hidroksil (OH-). Kjo substancë fitohet nga oksidimi i drejtpërdrejtë i inandionit - 1, 3, dhe, për rrjedhojë, sipas nomenklaturës ndërkombëtare, ka emrin e mëposhtëm: 2, 2 - dihidroksiinandion -1, 3 (Fig. 1).
Ninhidrin e pastër është një kristal i verdhë ose i bardhëngjyra që, kur nxehen, treten mirë në ujë dhe në tretës të tjerë organikë polare, si acetoni. Kjo është një substancë mjaft e dëmshme, nëse bie në kontakt me lëkurën në sasi të mëdha ose me mukozën, shkakton acarim, përfshirë edhe kur thithet. Puna me këtë përbërje duhet të jetë e kujdesshme dhe vetëm me doreza, pasi kur bie në kontakt me lëkurën, ajo reagon me proteinat e qelizave të lëkurës dhe e njollos atë në ngjyrë vjollcë.
Substancat reaktive
Siç u përmend më lart, reaksioni i ninhidrinës përdoret kryesisht për përcaktimin vizual të përmbajtjes së amino-komponimeve:
- a-aminoacide (përfshirë në proteina);
- amino sheqerna;
- alkaloide që përmbajnë –NH2 dhe grupe -NH;
- amine të ndryshme.
Duhet të theksohet se aminet sekondare dhe terciare ndonjëherë reagojnë shumë dobët, kështu që nevojiten më shumë kërkime për të konfirmuar praninë e tyre.
Për përcaktimin sasior përdoren metoda të ndryshme kromatografie, për shembull, kromatografia në letër (BC), kromatografia me shtresë të hollë (TLC) ose me larje të bartësve të ngurtë me një tretësirë të ninhidrinës në media të ndryshme.
Ky reaksion nuk është specifik për amino-komponimet, pasi reagjenti mund të hyjë në të me të gjitha menjëherë. Megjithatë, nga ana e produkteve të reaksionit, ai ka një veçanti në formën e lëshimit të flluskave të dioksidit të karbonit (CO2), dhe kjo është tipike vetëm kur ndërvepron me α-amino. acide.
Veçoritë e mekanizmit
BEkzistojnë interpretime të ndryshme të ekuacionit të reaksionit të ninhidrinës në literaturë. Disa studiues e lënë jashtë formimin e hidindantinës nga 2-aminoinandioni, i cili, me pjesëmarrjen e amoniakut dhe ninhidrinës, gjithashtu formon një substancë ngjyrosëse të quajtur "vjollca e Rueman" (ose "blu e Rueman"), ndërsa të tjerët, përkundrazi, supozojnë vetëm atë. pjesëmarrje pa praninë e produkteve të ndërmjetme amino. Ekzistojnë gjithashtu disa pika interesante në regjistrimin e vetë reagimit, në veçanti, kjo ka të bëjë me metodat e lidhjes së derivatit amino të ninhidrinës në molekulën e saj kryesore për të formuar një ngjyrë. Tregimi i vendit të "hidrogjenit në këmbë" i marrë nga amina e ndërmjetme nga mjedisi ujor gjithashtu mbetet i diskutueshëm: ai mund të jetë ose në grupin e ketonit ose pranë –NH2.
Në realitet, nuanca me atomin H është e parëndësishme, pasi pozicioni i tij në përbërje nuk luan një rol të veçantë në rrjedhën e reaksionit, kështu që nuk duhet t'i kushtohet vëmendje. Sa i përket mospërfshirjes së njërës prej fazave të mundshme, arsyeja këtu qëndron në aspektin teorik: deri më tani, mekanizmi i saktë i formimit të vjollcës së Rueman-it nuk është përcaktuar saktësisht, kështu që mund të gjenden skema krejt të ndryshme të reaksionit të ninhidrinës.
Kursi më i plotë i mundshëm i ndërveprimit të reagentit me amino-komponimet do të propozohet më poshtë.
Mekanizmi i reagimit
Së pari, ninhidrin ndërvepron me α-aminoacidin, duke e bashkuar atë në vendin e ndarjes së grupeve hidroksi dhe duke formuar një produkt kondensimi (Fig. 2a). Më pas, ky i fundit shkatërrohet, duke çliruar aminën e ndërmjetme, aldehidin dhe dioksidin e karbonit (Fig. 2b). Nga produkti përfundimtar kur bashkohetninhidrin, sintetizohet struktura vjollce Rueman (diketonhidrindenketohidrinamine, Fig. 2c). Tregohet gjithashtu edhe formimi i mundshëm i hidrindatinës (ninhidrinës së reduktuar) nga amina e ndërmjetme, e cila gjithashtu kthehet në një përbërje ngjyrosëse në prani të amoniakut (më saktë, hidroksidit të amonit) me një tepricë të vetë reagjentit (Fig. 2d).
Formimi i hidrindantinës u vërtetua nga vetë Rueman kur sulfuri i hidrogjenit vepron në molekulën e ninhidrinës. Ky përbërës është në gjendje të shpërndahet në karbonat natriumi Na2CO3, duke e ngjyrosur tretësirën të kuqe të errët. Dhe kur shtohet acidi klorhidrik i holluar, hidridantina precipiton.
Me shumë mundësi, amina e ndërmjetme, hidridantina, ninhidrina dhe struktura e bojës, për shkak të paqëndrueshmërisë së tyre kur nxehen, janë në njëfarë ekuilibri, gjë që lejon praninë e disa fazave shtesë.
Ky mekanizëm është i përshtatshëm për shpjegimin e reaksionit të ninhidrinës me përbërës të tjerë amino, me përjashtim të nënprodukteve që rezultojnë nga eliminimi i pjesës tjetër të strukturës nga –NH2, -NH ose -N.
Test biuret dhe reagime të tjera ndaj proteinave
Analiza cilësore për lidhjet peptide edhe të strukturave joproteinike mund të bëhet jo vetëm me pjesëmarrjen e reagentit të mësipërm. Megjithatë, në rastin e një reaksioni të ninhidrinës ndaj proteinave, ndërveprimi nuk zhvillohet përgjatë grupeve –CO-NH‒, por përgjatë grupeve aminore. Ekziston një i ashtuquajtur "reaksion biureti", i cili karakterizohet nga shtimi i joneve në tretësirë me amino-komponime.bakri bivalent nga CuSO4 ose Cu(OH)2 në një mjedis alkalik (Fig. 3).
Gjatë analizës, në prani të strukturave të nevojshme, tretësira merr ngjyrë blu të errët për shkak të lidhjes së lidhjeve peptide në një kompleks ngjyrash, i cili dallon një reagent nga tjetri. Kjo është arsyeja pse reaksionet e biuretit dhe ninhidrinës janë universale në lidhje me strukturat proteinike dhe joproteinike me grupin –CO-NH‒.
Gjatë përcaktimit të aminoacideve ciklike, përdoret një reaksion ksantoproteinik me një tretësirë të koncentruar të acidit nitrik HNO3 , i cili jep një ngjyrë të verdhë kur nitratohet. Një pikë e reagentit në lëkurë gjithashtu shfaq një ngjyrë të verdhë duke reaguar me aminoacidet në qelizat e lëkurës. Acidi nitrik mund të shkaktojë djegie dhe duhet të trajtohet gjithashtu me doreza.
Shembuj të ndërveprimit me komponimet amino
Reaksioni i nihidrinës për α-aminoacidet jep një rezultat të mirë vizual, me përjashtim të strukturave të ngjyrës së prolinës dhe hidroksiprolinës, të cilat reagojnë me formimin e një ngjyre të verdhë. Një shpjegim i mundshëm për këtë efekt u gjet në kushte të tjera mjedisore të ndërveprimit të ninhidrinës me këto struktura.
Reagimi me grupin amino
Meqenëse testi nuk është specifik, zbulimi vizual i alaninës duke përdorur reaksionin e ninhidrinës në përzierje nuk është i mundur. Sidoqoftë, me anë të kromatografisë letre, kur aplikohen mostra të aminoacideve të ndryshme α, spërkatja e tyre me një tretësirë ujore të ninhidrinës dhe zhvillimi në një mjedis të veçantë, mund tëllogarit përbërjen sasiore jo vetëm të përbërjes së pretenduar, por edhe të shumë të tjerëve.
Skematikisht, ndërveprimi i alaninës me ninhidrinën ndjek të njëjtin parim. Ai lidhet me reagjentin në grupin amin dhe nën veprimin e joneve aktive të hidroniumit (H3O+) ndahet në karbon. -lidhja e azotit, që zbërthehet në acetaldehid (CH3COH) dhe dioksid karboni (CO2). Një tjetër molekulë ninhidrine ngjitet me azotin, duke zhvendosur molekulat e ujit dhe formohet një strukturë ngjyrosëse (Fig. 4).
Reaksion me një komponim amino heterociklik
Reaksioni i ninhidrinës me prolinën është specifik, veçanërisht në analizat kromatografike, pasi struktura të tilla në një mjedis acid fillimisht zverdhen dhe më pas kthehen në vjollcë në një mjedis neutral. Studiuesit e shpjegojnë këtë me një veçori të rirregullimit të ciklit në përbërjen e ndërmjetme, e cila ndikohet pikërisht nga prania e një numri të madh protonesh hidrogjeni që plotësojnë nivelin e jashtëm energjetik të azotit.
Shkatërrimi i heterociklit nuk ndodh, dhe një molekulë tjetër ninhidrinë është ngjitur në të në atomin e 4-të të karbonit. Pas ngrohjes së mëtejshme, struktura që rezulton në një mjedis neutral kthehet në vjollcë Rueman (Fig. 5).
Përgatitja e reagentit kryesor
Testi i Ninhidrinës kryhet me tretësira të ndryshme, në varësi të shpërbërjes së strukturave amino në disa organike dhekomponimet inorganike.
Reagenti kryesor është përgatitja e një tretësire 0.2% në ujë. Kjo është një përzierje e gjithanshme, pasi shumica e përbërjeve treten mirë në H2O. Për të marrë një reagent të sapopërgatitur, një mostër prej 0,2 g ninhidrinë të pastër kimikisht hollohet në 100 ml ujë.
Vlen të theksohet se për disa solucione të analizuara ky përqendrim është i pamjaftueshëm, ndaj mund të përgatiten tretësirë 1% ose 2%. Kjo është tipike për ekstraktet nga lëndët e para medicinale, pasi ato përmbajnë klasa të ndryshme të amino-komponimeve.
Gjatë kryerjes së studimeve kromatografike, tretësirat, për shembull, kur lani një përzierje në një bartës të ngurtë përmes një kolone, mund të përgatiten në alkool, dimetil sulfoksid, aceton dhe tretës të tjerë polare - gjithçka do të varet nga tretësi i caktuar. strukturat amino.
Aplikacion
Reaksioni i ninhidrinës bën të mundur zbulimin e shumë amino-komponimeve në tretësirë, gjë që e bëri atë një nga të parët që përdoret në analizën cilësore të substancave organike. Përcaktimi vizual redukton ndjeshëm numrin e eksperimenteve, veçanërisht kur analizohen bimët, barnat dhe format e dozimit të studiuara dobët, si dhe zgjidhjet dhe përzierjet e panjohura.
Në shkencën e mjekësisë ligjore, kjo metodë përdoret gjerësisht për të përcaktuar praninë e shenjave të djersës në çdo sipërfaqe.
Edhe pavarësisht nga jospecifiteti i reaksionit, tërheqja e reaksionit të ninhidrinës nga praktika kimike është e pamundur, pasiZëvendësimi i kësaj substance me analoge më pak toksike (për shembull, oksolin) vërtetoi se ato kanë ndjeshmëri më të dobët ndaj amino grupeve dhe nuk japin rezultate të mira në analizat fotometrike.
