Çfarë qëndron në themel të hibridizimit të ADN-së? Megjithëse sekuenca e ADN-së me dy fije është përgjithësisht e qëndrueshme në kushte fiziologjike, ndryshimi i këtyre kushteve në laborator (zakonisht duke rritur temperaturën e ambientit) do të bëjë që molekulat të ndahen në vargje individuale. Këto të fundit janë plotësuese me njëra-tjetrën, por mund të plotësojnë edhe sekuenca të tjera të pranishme në mjedisin e tyre. Ulja e temperaturës së ambientit lejon që molekulat me një fije floku të kalojnë ose "hibridizohen" me njëra-tjetrën. Kjo është metoda e hibridizimit të ADN-së.
Koncepti nga pikëpamja e biologjisë molekulare
Shkencëtarët e përfshirë si në replikimin e ADN-së ashtu edhe në transkriptimin e ADN-së në ARN mbështeten në kryqëzimet e nukleotideve dhe teknikat e biologjisë molekulare. Kjo përfshin njollat Southern dhe Northern, reaksionin zinxhir polimerazë (PCR) dhe shumicën e qasjeve të hibridizimit dhe renditjes së ADN-ARN-së.
Aplikacion
Hibridizimi është vetia kryesore e nukleotidevesekuenca dhe përdoret në metoda të shumta të biologjisë molekulare. Marrëdhënia e përgjithshme gjenetike e dy specieve mund të përcaktohet duke hibridizuar segmentet e ADN-së së tyre (hibridizimi ADN-ADN). Për shkak të ngjashmërive të sekuencës midis organizmave të lidhur ngushtë, kërkohet një temperaturë më e lartë për të shkrirë hibride të tilla të ADN-së në krahasim me organizmat më të largët. Metoda të ndryshme përdorin hibridizimin për të përcaktuar origjinën e një kampioni të ADN-së, duke përfshirë reaksionin zinxhir polimerazë (PCR). Në një metodë tjetër, sekuencat e shkurtra të ADN-së hibridizohen me mRNA qelizore për të identifikuar gjenet e shprehura. Kompanitë farmaceutike po eksplorojnë përdorimin e ARN-së antisense për t'u lidhur me mARN-në e padëshiruar, duke parandaluar ribozomin të përkthejë mRNA në proteinë.
Hibridizimi ADN-ADN në përgjithësi i referohet një teknike të biologjisë molekulare që mat shkallën e ngjashmërisë gjenetike midis grupeve të sekuencave të ADN-së. Zakonisht përdoret për të përcaktuar distancën gjenetike midis dy organizmave. Është përdorur gjerësisht në filogjeni dhe taksonomi.
Metodologji
ADN nga një organizëm u etiketua, më pas u përzie me ADN të paetiketuar që mund të krahasohej me të. Përzierja inkubohet për të lejuar që vargjet e ADN-së të shkëputen dhe më pas të ftohet për të formuar një ADN hibride të rigjeneruar me dy vargje. Sekuencat e hibridizuara me një shkallë të lartë ngjashmërie do të lidhen më fort dhe do të kërkojnë më shumë energji për t'i ndarë ato: d.m.th., ato ndahen kur nxehen në një nivel më të lartë.temperatura sesa sekuenca të ndryshme, një proces i njohur si "shkrirja e ADN-së".
Shkrirja e ADN-së
Duke vlerësuar profilin e shkrirjes së ADN-së së hibridizuar, ADN-ja me dy zinxhirë lidhet me një të ashtuquajtur "kolona" dhe përzierja që rezulton nxehet. Në çdo hap, kolona lahet dhe sekuencat e ADN-së që shkrihen bëhen të vetme dhe lahen nga kolona. Temperaturat në të cilat ADN-ja e etiketuar del nga kolona pasqyron sasinë e ngjashmërisë midis sekuencave (dhe modeli i vetë-palosjes shërben si kontroll). Këto rezultate kombinohen për të përcaktuar shkallën e ngjashmërisë gjenetike midis organizmave. Sipas mikrobiologjisë moderne, hibridizimi i ADN-së është i pamundur pa i kuptuar këto gjëra.
Kur lloje të shumta të acidit ribonukleik (ose deoksiribonukleik) krahasohen në këtë mënyrë, vlerat e ngjashmërisë lejojnë që speciet të vendosen në pemën filogjenetike. Prandaj, kjo është një nga qasjet e mundshme për të kryer sistematikë molekulare. Charles Sibley dhe John Ahlquist, pionierët e kësaj teknike, përdorën hibridizimin ADN-ADN për të studiuar marrëdhëniet filogjenetike të shpendëve (taksonomia Sibley-Ahlquist) dhe primatëve.
Rëndësia për biologjinë
Hibridizimi ADN-ADN është standardi i artë për dallimin e specieve bakteriale, me një vlerë ngjashmërie prej më shumë se 70%, që tregon se shtamet e krahasuara i përkasin specieve të ndryshme. Në vitin 2014, u propozua një prag prej 79% ngjashmërie për ndarjen e një nëngrupi bakterial.
Kritikët pretendojnë se teknika është e pasaktë për krahasimin e specieve të lidhura ngushtë, pasi çdo përpjekje për të matur dallimet midis sekuencave ortologjike midis organizmave është e mbingarkuar nga hibridizimi i homologëve paralogë në gjenomin e një organizmi. Sekuenca e ADN-së dhe krahasimet e sekuencave llogaritëse janë aktualisht metoda e përdorur zakonisht për përcaktimin e distancës gjenetike, megjithëse kjo qasje përdoret ende në mikrobiologji për të ndihmuar në identifikimin e baktereve.
Mënyra aktuale është kryerja e hibridizimit të ADN-ADN-së në silikon duke përdorur gjenome të sekuencuara plotësisht ose pjesërisht. GGDC i zhvilluar nga DSMZ është mjeti më i saktë i njohur për llogaritjen e vlerave të ngjashme me DDH. Ndër përmirësimet e tjera algoritmike, ai zgjidh problemin me sekuencat paraloge duke i filtruar me kujdes ato nga përputhjet midis dy sekuencave të gjenomit.
metoda FISH
Hibridizimi i Fluoreshencës In Situ (FISH) është një teknikë laboratorike që përdoret për të zbuluar dhe renditur ADN-në, shpesh në një kromozom specifik.
Në vitin 1969, Joseph Gall dhe Mary Lou Pardu botuan një punim që demonstronte se kopjet radioaktive të një sekuence të ADN-së ribozomale mund të përdoren për të zbuluar sekuencat plotësuese të ADN-së në bërthamën e një veze bretkose. Që nga këto vëzhgime origjinale, shumë përmirësime kanë rritur shkathtësinë dhendjeshmëria e procedurës në një masë të tillë që hibridizimi in situ ("në vend", latinisht) konsiderohet tani një mjet i rëndësishëm në citogjenetikë. (Termi in situ tani përdoret gjithashtu për t'iu referuar fazës fillestare të rritjes së karcinomës, kur në procesin patologjik përfshihet vetëm indi epitelial.)
Sekuenca hibridizimi fluoreshente
Sondat
ARN mund të dizajnohen për çdo gjen ose çdo sekuencë brenda një gjeni për të vizualizuar lncRNA dhe miRNA mRNA në inde dhe qeliza. FISH përdoret duke studiuar ciklin e riprodhimit të qelizave, në veçanti interfazën bërthamore për çdo anomali kromozomale. FISH ju lejon të analizoni një seri të madhe rastesh arkivore, është shumë më e lehtë të identifikoni kromozomin e identifikuar duke krijuar një sondë me një bazë kromozomi artificial që do të tërheqë kromozome të ngjashme.
Sinjalet e hibridizimit për çdo sondë kur zbulohet një anomali bërthamore: çdo sondë e zbulimit të mRNA dhe lncARN përbëhet nga 20 palë oligonukleotide, secila palë mbulon një hapësirë prej 40-50 bp. p. Sondat përdorin kiminë e vet për të zbuluar mARN.
Hibridizimi me sondat e ADN-së
Sondimet shpesh bëhen nga fragmente të ADN-së që janë izoluar, pastruar dhe përforcuar për t'u përdorur në hartimin e gjenomit njerëzor. Madhësia e gjenomit njerëzor është aq e madhe në krahasim me gjatësinë që mund të renditet drejtpërdrejt, saqë është e nevojshme të ndahet nëfragmente. Në fund të fundit, këto fragmente u renditën duke tretur një kopje të secilit fragment në njësi edhe më të vogla duke përdorur endonukleaza specifike të sekuencës për të matur madhësinë e secilit fragment të vogël duke përdorur kromatografinë e përjashtimit të madhësisë duke përdorur këtë informacion për të përcaktuar se ku fragmentet e mëdha mbivendosen me njëra-tjetrën..
Për të ruajtur elementët me sekuencat e tyre individuale të ADN-së, fragmentet u shtuan në një sistem popullatash bakteriale që përsëriten vazhdimisht. Popullatat klonale të baktereve, secila popullatë mban një kromozom të vetëm artificial, ruhen në laboratorë të ndryshëm në mbarë botën. Kromozomet artificiale (BAC) mund të rriten, nxirren dhe etiketohen në çdo laborator që përmban një bibliotekë. Bibliotekat gjenomike shpesh emërtohen sipas institucioneve ku janë zhvilluar. Një shembull është biblioteka RPCI-11, e quajtur sipas Institutit të Kancerit Roswell në Buffalo (Nju Jork, SHBA). Këto fragmente përbëjnë rreth 100 mijë çifte bazash dhe janë baza e shumicës së sondave FISH.
